玉米穗三叶叶长和叶面积的QTL定位

王新涛，杨 青，李保叶，代资举，郝俊杰

(1.河南省农业科学院 植物保护研究所，河南 郑州 450002；
2.河南省农业科学院 芝麻研究中心，河南 郑州 450002；
3.河南省作物分子育种研究院，河南 郑州 450002)

玉米(ZeamaysL.)是我国种植面积最大、总产量最多的粮、经、饲兼用作物，对保障国家粮食安全和国民经济发展具有重要的战略意义[1]。玉米叶片是进行光合作用的重要器官，通过感知温度、光照和水分等外界信息调控一系列体内信号通路，通过调节叶片相关性状的变化进而影响干物质的积累以及产量的形成[2]。研究表明，玉米穗三叶(穗上叶、穗位叶和穗下叶)叶面积与单株穗质量存在显著的正相关关系，可作为育种工作者早期判断杂交组合优劣的依据[3]。因此，深入挖掘控制玉米穗三叶叶长和叶面积的QTL位点，对于解析玉米叶片发育的分子机制和开展理想株型育种具有重要的意义。

近年来随着分子标记技术的不断发展进步，对玉米叶片相关性状的QTL定位研究也取得了重要进展，促进了复杂数量性状的遗传解析和分子标记辅助育种应用。Agrama等[4]首次利用214个F2：3家系在2种氮肥条件下定位到7个穗位叶叶面积QTL。刘建超等[5]以叶面积差异显著的亲本478×武312构建重组自交系群体，2 a共定位到7个穗三叶叶面积QTL，其中在第2染色体的umc1542～umc1518标记区间发现一个主效QTL位点。Ku等[6]利用256个F2：3家系，在玉米的第1，2，3，5，7，8号染色体上定位到10个叶宽和叶长QTL。Zheng等[7]利用玉米重组自交系在高氮条件下定位到9个穗位叶相关性状(叶长、叶宽和叶面积)QTL，能够解释5.4%～14.8%的表型变异；
低氮条件下定位到7个穗位叶相关性状的QTL，可以解释5.5%～20.5%的表型变异。安允权等[8]利用259个单株的F2群体，在玉米第1，2，3，5号染色体上共定位到36个叶面积QTL，且发现不同叶位叶面积的QTL存在集中分布现象。罗巧玲等[9]通过自交系郑58和B73构建F2群体，在第1，2，3，4，5，6号染色体上检测到11个控制叶长的QTL，单个QTL的表型贡献率为3.69%～25.53%。白明兴等[10]则通过253份玉米自交系对穗三叶性状(叶长、叶宽及叶面积)进行全基因组关联分析，检测到21个显著的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)。从上述定位结果可以发现，叶部尤其是穗位叶相关性状属于典型的数量性状，不同遗传背景下定位获得的QTL不尽一致，并且受环境影响较大，限制了其在育种中的利用效率。

为了加快育种进程，我国中低纬度地区的育种单位在当地一般会种植春播和夏播两季玉米，播期不同造成玉米生长发育过程中的温度、水分、光照等生态因子发生改变，影响叶片生长速率、大小以及光合速率，最终对产量产生影响[11-12]。研究发现，春播环境下，穗三叶叶面积以多基因遗传为主；
夏播环境下，穗三叶叶面积则以主基因遗传为主[13]。现有关于玉米叶片性状的QTL研究多集中于不同地点和不同年份，而对于春播和夏播不同播期下的定位研究很少。因此，在不同的播期条件下，挖掘稳定表达或者新的控制玉米叶片相关性状QTL，对于进一步解析玉米叶片的遗传组成十分必要。

本研究利用玉米叶片大小存在显著差异的自交系郑58和D863F构建重组自交系群体，在2 a的春播、夏播不同环境条件下，对穗三叶叶长和叶面积进行QTL定位，旨在为解析玉米叶片相关性状的遗传基础和开展玉米理想株型分子育种工作提供有益参考。

1.1 试验材料

试验材料为自交系郑58和D863F及其组配构建的含241个家系的RIL群体[14]。其中，郑58具有配合力高、耐密植、抗逆性强等综合优良性状，是我国核心骨干玉米自交系；
D863F对多种玉米病害如粗缩病、南方锈病和弯孢叶斑病等都具有较好的抗性，是优良的抗性育种材料。

1.2 田间试验和性状调查

将RIL群体及其亲本分别于2018年(4月18日春播、6月10日夏播)和2019年(4月19日春播、6月12日夏播)种植于河南原阳(35°05′N，113°96′E)河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地，行长2 m，行距0.60 m，株距0.25 m，3次重复，常规大田管理。

玉米散粉吐丝7 d后，从每个株系的第3株开始选择长势整齐一致的植株，分别测量穗三叶的叶长(Leaf length，LL)和叶宽(Leaf width，LW)，利用测量的叶长和叶宽值计算其叶面积(Leaf area，LA)，穗下叶、穗位叶和穗上叶叶长/面积分别命名为FirLL/LA、SecLL/LA和ThiLL/LA。其中，叶长用尺子从叶耳至叶尖进行测量，叶宽测量叶片的最大宽度，对应的叶面积计算方法：LA=LL×LW×0.75[15]。

1.3 遗传连锁图谱构建及QTL定位

利用筛选出来的215对具有多态性的SSR标记对RIL群体进行基因型分析，应用JoinMap 4.0软件构建遗传连锁图谱，该遗传连锁图谱全长1 832.35 cM，标记间的平均距离为8.52 cM[16]。采用IciMapping v4.0对2 a不同环境下的穗三叶叶长和叶面积进行QTL定位分析，软件参数LOD阈值为2.5，步长为1 cM，PIN值为0.01，进行1 000次模拟运算检测。

检测到的QTL命名方式：q+性状+染色体位置，相同染色体不同区间若存在多个QTL位点，则在其后加数字1，2，3等进行区分。

2.1 亲本和RIL群体穗三叶叶长和叶面积表型分析

在春播和夏播不同环境条件下，玉米双亲和RIL群体的叶长和叶面积表现出一定的差异(表1、图1—4)。夏播条件下双亲及RIL群体的叶长和叶面积均大于春播条件下的性状值。相同环境条件下郑58的穗三叶叶长(58.67～78.03 cm)等于或略高于D863F(57.00～77.28 cm)，郑58的穗三叶叶面积(267.39～424.55 cm2)低于D863F(358.65～566.72 cm2)。RIL群体中不同株系的穗三叶叶长和叶面积均表现出较大的变异，其峰度和偏度的绝对值均小于1，基本符合正态分布，这些结果表明穗三叶叶长和叶面积属于受多基因控制的数量性状，该群体适合做进一步深入分析和QTL定位研究。

表1 不同环境下玉米亲本及RIL群体叶片相关性状分析Tab.1 Phenotypic value statistics of leaf related traits in parents and RIL population under different environments

2.2 不同播期条件下RIL群体穗三叶各表型性状相关分析及遗传力分析

对2 a不同播期环境下RIL群体的穗三叶叶长和叶面积进行相关性分析，结果表明(表2)，玉米RIL群体穗下叶、穗位叶、穗上叶的叶长和叶面积两两之间呈极显著正相关。春播环境下，穗下叶和穗位叶叶面积的相关系数最大，2018，2019年分别为0.93和0.91；
穗下叶叶长和穗上叶叶面积的相关系数最小，分别为0.71和0.67。夏播环境下，穗下叶和穗位叶叶长的相关系数最大，2018，2019年分别为0.95和0.94；
穗上叶叶长和穗下叶叶面积的相关系数最小，分别为0.63和0.47。

图1 2018年春播玉米RIL群体叶长和叶面积的频率分布Fig.1 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in spring sowing environment of 2018

图2 2018年夏播玉米RIL群体叶长和叶面积的频率分布Fig.2 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in summer sowing environment of 2018

对2 a不同播期环境下RIL群体的穗三叶叶长和叶面积进行方差分析(表3)，发现穗下叶、穗位叶和穗上叶的叶长和叶面积在基因型、环境以及基因型×环境互作下的差异均达到极显著水平(P<0.01)，且广义遗传力较高，分别为88.04%，88.45%，87.86%，85.04%，85.27%和85.73%。

2.3 玉米穗三叶叶长和叶面积的QTL定位

在不同播期环境下，共检测到23个与玉米穗三叶叶长和叶面积性状有关的QTL，其中穗三叶叶长14个，叶面积9个(表4)。其中，在2 a春播环境下检测到5个叶长QTL和4个叶面积QTL，2 a夏播环境下检测到12个叶长QTL和7个叶面积QTL，2个QTL在3个环境下被同时检测到，10个QTL在2个环境下被重复检测到，其余11个QTL仅能在单一环境下被检测到。这些QTL分布于玉米的第1，2，4，5，6，8号染色体上，单个QTL可以解释5.84%～17.81%的表型变异。

图3 2019年春播玉米RIL群体叶长和叶面积的频率分布Fig.3 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in spring sowing environment of 2019

图4 2019年夏播玉米RIL群体叶长和叶面积的频率分布Fig.4 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in summer sowing environment of 2019

表2 玉米RIL群体叶片性状的相关性分析Tab.2 Correlation analysis among traits related with leaf in maize RIL population

表3 不同环境下玉米RIL群体叶片相关性状的方差分析Tab.3 Variance analysis on traits related with leaf in maize RIL population under different environments

穗下叶叶长：检测到6个控制穗下叶叶长的QTL，分布于第1，2，4，5，8号染色体上(表4)。春播和夏播环境下分别检测到3，5个相关的QTL，其中qFirLL5-1在3个环境下被检测到，qFirLL1-1、qFirLL1-2、qFirLL4-1和qFirLL8-1在2个环境下被重复检测到，qFirLL2-1只在1个环境下被检测到。qFirLL1-1、qFirLL2-1和qFirLL5-1的贡献率分别达到10.49%(2018夏播)、11.70%(2019夏播)和10.82%(2018夏播)。

穗位叶叶长：检测到5个控制穗位叶叶长的QTL，分布于第1，2，4，5号染色体上(表4)。春播和夏播环境下分别检测到1，5个相关的QTL，其中qSecLL1-1和qSecLL1-2在2个环境下被重复检测到，qSecLL2-1、qSecLL4-1和qSecLL5-1只在1个环境下被检测到。qSecLL1-2和qSecLL2-1的贡献率分别达到10.87%(2018春播)和13.47%(2019夏播)。

穗上叶叶长：检测到3个控制穗上叶叶长的QTL，分布于第2，4，5号染色体上(表4)。春播和夏播环境下分别检测到1，2个相关的QTL，其中qThiLL2-1和qThiLL5-1在2个环境下被重复检测到，qThiLL4-1只在1个环境下被检测到。qThiLL2-1贡献率分别达到11.87%(2018夏播)和11.83%(2019夏播)，qThiLL4-1的贡献率达到11.49%(2019夏播)。

穗下叶叶面积：检测到4个控制穗下叶叶面积的QTL，分布于第1，2，5，6号染色体上(表4)。春播和夏播环境下分别检测到2，3个相关的QTL，其中qFirLA2-1在3个环境下被检测到，qFirLA1-1、qFirLA5-1和qFirLA6-1只在1个环境下被检测到。qFirLA2-1的贡献率分别达到17.81%(2019春播)和10.97%(2019夏播)，qFirLA5-1的贡献率达到11.42%(2018夏播)。

穗位叶叶面积：检测到3个控制穗位叶叶面积的QTL，分布于第1，2，5号染色体上(表4)。春播和夏播环境下分别各检测到2个相关的QTL，其中qSecLA1-1和qSecLA2-1在2个环境下被重复检测到，qSecLA5-1只在1个环境下被检测到。qSecLA2-1的贡献率分别达到11.54%(2019春播)和14.08%(2019夏播)，qSecLA5-1的贡献率达到10.10%(2018夏播)。

穗上叶叶面积：检测到2个控制穗上叶叶面积的QTL，分布于第2，5号染色体上(表4)。只在夏播环境下检测到2个相关的QTL，且qThiLA2-1和qThiLA5-1只在1个环境下被检测到，其中qThiLA2-1的贡献率达到10.80%(2019夏播)。

穗三叶叶长和叶面积共定位：2 a不同环境条件下，在第2号染色体bnlg1316～bnlg1141区间内同时检测到影响穗下叶叶长、穗位叶叶长、穗上叶叶长、穗下叶叶面积、穗位叶叶面积和穗上叶叶面积的QTLqFirLL2-1、qSecLL2-1、qThiLL2-1、qFirLA2-1、qSecLA2-1和qThiLA2-1，贡献率为10.05%～17.81%，增效等位基因来源于D863F，为主效QTL位点。在第5号染色体umc1591～umc2298区间内也同时检测到控制这6个性状的QTLqFirLL5-1、qSecLL5-1、qThiLL5-1、qFirLA5-1、qSecLA5-1和qThiLA5-1，贡献率为6.42%～11.42%，增效等位基因也来自D863F。

表4 玉米RIL群体叶片性状相关的QTLTab.4 QTLs related with leaf traits in maize RIL population

表4(续)

由于玉米穗三叶对产量的贡献率接近70%，因此在玉米育种进程中，叶片特别是穗位叶相关性状是重要的株型选择指标之一[17]。白明兴等[10]研究表明，玉米穗三叶的叶长、叶宽和叶面积等性状紧密联系又相互促进，呈现显著或极显著正相关关系；
钟源等[18]通过对187份玉米自交系穗三叶表型测定，发现叶长与叶面积间呈极显著正相关。这些结论与本研究的结果相似，由此可见，在对叶片相关性状进行改良时，可以对容易考察的性状指标如叶长进行选择，从而达到和叶面积性状协同改良的效果。

叶片相关性状属于多基因控制的数量性状，其遗传机制复杂且容易受环境影响[19]。本研究利用重组自交系群体对穗三叶的叶长和叶面积进行QTL定位，检测到调控穗三叶叶长的QTL 14个，叶面积有关的QTL 9个。其中，在第2号染色体bnlg1316～bnlg1141区间内同时检测到影响穗下叶叶长、穗位叶叶长、穗上叶叶长、穗下叶叶面积、穗位叶叶面积和穗上叶叶面积的QTL，贡献率均大于10%，与Cai等[20]定位的叶面积、叶长QTLqLA2和qLL2-2以及Wang等[21]定位的叶长QTLqLLa2-1区间一致。在第5号染色体umc1591～umc2298区间内也同时检测到控制这6个性状的QTL，与Ku等[6]定位的叶长QTLqLL5-2一致。通过MetaQTL分析发现，该位点存在1个控制玉米叶形性状的“一因多效”QTL，候选基因为GRMZM2G171349，其主要参与植物激素的合成与代谢，进而调控叶片的发育[22-23]。由此推测，以上2个QTL可靠性较高，是控制叶片相关性状表型变异的重要位点，该区段进一步的精细定位和基因克隆对解析玉米叶片性状的遗传基础和株型育种改良具有重要意义。

春播和夏播环境下，玉米叶面积受主基因和多基因调控的表现差异明显，即受基因控制的遗传表现并非一致[13]。本研究同时在春、夏播环境下检测到叶长QTL有 3个(qFirLL1-2、qFirLL5-1和qSecLL1-2)，叶面积QTL有2个(qFirLA2-1和qSecLA2-1)，其余位点只能单独在春播或夏播环境下被检测到。因此，在不同的播期环境下，挖掘稳定表达的控制玉米叶片相关性状QTL，并根据不同的育种环境制定相应的育种策略，对定向提高叶片相关性状的育种效率具有重要意义。

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